Репликация, или редупликация, ДНК
Репликация ДНК — это процесс ее удвоения перед делением клетки и ее основное свойство как наследственного материала. Иногда говорят "редупликация ДНК".
Очевидно, самокопирование генетического материала в живой природе есть необходимость. Только так образующиеся при делении дочерние клетки могут содержать столько же ДНК, сколько ее изначально было в исходной. Благодаря репликации все генетически запрограммированные особенности строения и метаболизма передаются в ряду поколений.
В процессе деления клетки каждая молекула ДНК из пары идентичных отходит в свою дочернюю клетку. Таким образом обеспечивается точная передача наследственной информации.
При синтезе ДНК потребляется энергия, т. е. это энергозатратный процесс.
Кратко редупликацию можно описать следующим образом. Под действием специального фермента (ДНК-полимеразы) разрываются водородные связи между нуклеотидами двух цепочек ДНК. К освободившимся связям по принципу комплиментарности присоединяются соответствующие нуклеотиды (к аденину тимин, к гуанину цитозин). Следовательно, порядок нуклеотидов в "старой" цепочке ДНК определяет порядок нуклеотидов в новой, то есть "старая" цепочка ДНК как бы является матрицей для синтеза "новой". Такие реакции называются реакциями матричного синтеза; они характерны только для живого.
Таким образом, репликация ДНК происходит полуконсервативным способом, когда каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую цепь и одну вновь синтезированную. Такой механизм репликации был доказан в 1958 году.
У эукариот репликация происходит в S-фазе интерфазы клеточного цикла.
Описанный ниже механизм и основные ферменты характерны для подавляющего большинства организмов. Однако бывают исключения, в основном среди бактерий и вирусов.
Репликацию ДНК обеспечивает целый комплекс ферментов, который называется реплисомой. Ферменты и другие белки репликации действуют совместно, образуя комплекс и двигаясь по ДНК. Всего в процессе участвует около 20 разных белков, ниже будут упомянуты лишь основные.
Расхождение цепей исходной молекулы ДНК обеспечивает фермент геликаза, или хеликаза, который в определенных местах хромосом разрывает водородные связи между азотистыми основаниями ДНК. Хеликазы перемещаются по ДНК с затратой энергии АТФ.
Разошедшиеся в результате действия хеликазы нити матричной ДНК пытаются опять соединиться своими водородными связями. Чтобы этого не произошло, в действие вступают ДНК-связывающие, или дестабилизирующие, белки. Это не ферменты в том понимании, что реакций они не катализируют. Такие белки выстраиваются в ряд со стороны пентозо-фосфатного остова цепи, прикрепляются к нити ДНК и не дают комплементарным цепям матричной ДНК сомкнуться. В результате образуются зоны репликации, называемые репликационными вилками.
Репликационные вилки образуются не в любых местах ДНК, а только в точках начала репликации, состоящих из определенной последовательности нуклеотидов (около 300 штук). Такие места распознаются специальными белками, после чего образуется так называемый репликационный глаз, в котором расходятся две цепи ДНК.
Из точки начала репликация может идти как в одном, так и в двух направлениях по длине хромосомы. В последнем случае цепи ДНК расходятся вперед и назад, и из одного репликационного глазка образуются две репликационные вилки.
Если в каждом пузыре по две вилки, т. е. расхождение двунаправлено, то из точки инициализации на одной нити ДНК синтез будет идти в двух направлениях — вперед и назад. При этом в одну сторону будет выполняться непрерывный синтез, а в другую — фрагментами Оказаки (о них речь пойдет ниже).
Репликон — единица репликации ДНК, от точки ее начала и до точки ее окончания.
Поскольку в ДНК цепи спирально закручены относительно друг друга, то разделение их хеликазой вызывает появление дополнительных витков перед репликационной вилкой, то есть разрыв связей провоцирует еще большее ее скручивание. Представьте канат из двух закрученных относительно друг друга веревок, и вы с одной стороны за концы тянете одну вправо, другую — влево. Сплетенная часть станет еще больше скручиваться, будет более тугой.
Чтобы снять напряжение, молекула ДНК должна была бы проворачиваться вокруг своей оси один раз на каждые 10 пар разошедшихся нуклеодидов, именно столько образуют один виток спирали. В таком случае ДНК бы быстро вращалась с затратой энергии, "сбрасывая" возникающую сверхспирализацию. Но этого не происходит, т. к. природа нашла более эффективный способ справится с возникающим при репликации напряжением спирали.
Фермент топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК. Отсоединенный участок проворачивается на 360° вокруг второй целой цепи и снова соединяется со своей цепью. Другое описание: топоизомераза разрывает одну из нитей, пропускает через разрыв второю и снова сшивает первую. Этим снимается напряжение, т. е. устраняются супервитки.
Каждая отдельная цепь ДНК старой молекулы используется в качестве матрицы для синтеза новой комплементарной себе цепи. Добавление нуклеотидов к растущей дочерней цепи обеспечивает фермент ДНК-полимераза. Существует несколько разновидностей полимераз.
В репликационной вилке к освободившимся водородным связям цепей согласно принципу комплиментарности присоединяются свободные нуклеотиды, находящиеся в нуклеоплазме (или цитоплазме у бактерий). Присоединяющиеся нуклеотиды представляют собой дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), а конкретно дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Они похожи на АТФ, у которой три фосфатных остатка, два из которых связаны макроэргической связью. При разрыве таких связей выделяется много энергии. Также и у дезоксинуклеозидтрифосфатов две связи макроэргические.
После образования водородных связей ДНК-полимераза связывает нуклеотид фосфоэфирной связью с последним нуклеотидом синтезируемой дочерней цепи. При этом отделяется пирофосфат, включающий два остатка фосфорной кислоты, который потом расщепляется на отдельные фосфаты. Реакция отщепления пирофосфата в результате гидролиза энергетически выгодна, так как связь между первым, который уходит в цепь, и вторым фосфатными остатками богата энергией. Эта энергия используется полимеразой на реакцию полимеризации ДНК.
Полимераза не только удлиняет растущую цепь, но и способна "проверять", какой нуклеотид пытается присоединиться к концу и отсоединять ошибочные нуклеотиды, т. е. обладает корректирующей способностью. Если последний нуклеотид, который должен быть присоединен к новой цепи, не комплементарен матричному, то полимераза его удалит. Другими словами, частичная репарация ДНК, т. е. ее исправление ошибок репликации, происходит уже на этапе синтеза.
Цифры 5 и 3 обозначают номера атомов углерода в дезоксирибозе, входящей в состав каждого нуклеотида. Через эти атомы нуклеотиды связаны между собой фосфодиэфирными связями. И там, где у одной цепи 3' связи, у другой — 5', так как она перевернута, т. е. идет в другом направлении. Для наглядности можно представить, что вы положили руку на руку, как первоклашка, сидящий за партой.
ДНК-полимераза может присоединять нуклеотид только к -OH группе, находящейся при 3-м атоме углерода дезоксирибозы. Таким образом цепь синтезируется только со стороны своего 3´-конца. То есть синтез новой цепи ДНК идет в направлении от 5´- к 3´-концу.
Если бы цепи ДНК сначала полностью расходились, а потом на них уже строилась новая комплементарная, то это не было бы проблемой. Однако это не так, и поскольку цепи ДНК антипараллельны (одна нить идет в направлении от 5' конца к 3', а комплементарная ей — наоборот), а синтез новой цепи возможен только в направлении 5´→3´, то в репликационной вилке дочерние цепи будут синтезироваться в разных направлениях.
На матрице 3´→5´ сборка новой полинуклеотидной последовательности происходит по большей части непрерывно, так как эта цепь синтезируется в направлении 5´→3´. Антипараллельная матрица характеризуется 5´→3´ направлением, поэтому синтез дочерней цепи по ходу движения вилки здесь невозможен. Здесь он был бы 3´→5´, но ДНК-полимера не может присоединять к 5´-концу.
Поэтому синтез на матрице 5´→3´ выполняется небольшими участками — фрагментами Оказаки (названы в честь открывшего их ученого). Каждый фрагмент синтезируется в обратном ходу образования вилки направлении, что обеспечивает соблюдение правила сборки от 5´- к 3´-концу. Позже такие фрагменты "сшиваются" между собой.
Непрерывная сборка идет быстрее, чем фрагментарная. Поэтому одна из дочерних цепей ДНК называется лидирующей, или ведущей, вторая — запаздывающей, или отстающей, так как фрагментарная репликация выполняется медленнее.
На схеме нити родительской ДНК постепенно расходятся в направлении, в котором идет синтез ведущей дочерней цепи. Синтез отстающей цепи идет в обратную расхождению сторону, поэтому вынужден выполняться кусками.
Другим "недостатком" полимеразы является то, что она не может сама начать синтез участка дочерней цепи. Причина этого кроется в том, что ей необходим –OH-конец нуклеотида, уже соединенного с цепью. Поэтому необходима затравка, или праймер. Им выступает короткая молекула РНК, синтезируемая ферментом РНК-праймазой и спаренная с матричной цепью ДНК (комплиментарная ей). Синтез каждого участка Оказаки начинается со своей РНК-затравки. Та цепь, которая синтезируется непрерывно, обычно имеет один праймер.
На схеме выше затравки показаны только на отстающей цепи. На самом деле они есть и на лидирующей. Однако здесь нужен только один праймер на вилку.
Позже праймеры удаляются, дыры застраиваются. Праймеры удаляются экзонуклеазой. После удаления праймера "дыру" застраивает другой тип полимеразы. Однако при этом отдельные участки ДНК не сшиваются.
После удаления праймеров и застраивания брешей ДНК-полимеразой отдельные участки дочерней цепи ДНК сшиваются между собой ферментом ДНК-лигазой.
У прокариот репликация протекает быстрее: примерно 1000 нуклеотидов в секунду. В то время как у эукариот только около 100 нуклеотидов. Количество нуклеотидов в каждом фрагменте Оказаки у эукариот составляет примерно до 200, у прокариот — до 2000.
У эукариот каждая хромосома может содержать множество репликонов. Поэтому синтез начинается в нескольких точках, одновременно или нет.
ДНК прокариот не линейна, а имеет кольцевую структуру и лишь одну точку начала репликации. Таким образом, у прокариот кольцевые молекулы ДНК представляют собой один репликон.